原创 eryun 云生信学生物信息学
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世界上没有两片完全相同的叶子。对于多细胞生物来说，看似相同的细胞群，实际上细胞与细胞之间是存在差异的。例如，在肿瘤组织中，肿块中心的细胞，肿块边缘的细胞，以及远端转移的细胞，其转录组和基因组等遗传信息肯定是存在差异的。传统的研究方法，是在组织水平进行的，最终得到的是多个细胞信号值的平均水平，丢失了单个细胞异质性的信息。大家有没有发现，目前基于传统的转录组测序数据（bulk RNA-seq）已经很难发表高分文章了，而近年来出现的单细胞测序技术（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）能够检出混杂样品的异质性信息，将整个遗传学领域带入新的次元，将它与bulk RNA-seq相结合，轻松擦出5分+的火花。
今天为大家带来的是这篇今年9月份发表在Cancer Cell International（IF: 5.722）上的文章Single cell RNA-seq data and bulk gene profiles reveal a novel signature of disease progression in multiple myeloma。这篇文章将bulk基因芯片数据与scRNA-seq数据相结合揭示了多发性骨髓瘤的疾病进程。赶紧跟随小编一起看看吧。
研究背景
多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）的发展涉及一个多步骤的转化过程，即未明的单克隆丙球病（MGUS），阴燃MM（SMM）和新诊断的MM（NDMM），最终进展为复发或难治性MM（RRMM），但细胞遗传学异常和分子改变在决定MM细胞命运中的作用仍不清楚。因此，该研究分析了scRNA-seq数据和bulk基因表达谱数据，揭示了一个与MM发展相关的新的基因signature。
分析流程
研究结果
1. scRNA-seq显示了MM疾病发展过程中的基因表达模式
基于scRNA-seq数据集GSE118900，共鉴定出597个细胞，表达基因16568个（图1a-c）。使用高度可变的基因对597个细胞进行无偏倚PCA，将这些细胞分成7个不同的簇（cluster），每个簇由不同时期MM患者的细胞组成（图1d，e）。标记物在每个簇的单个细胞中的表达模式如图1f所示。临床资料、荧光原位杂交结果和聚类结果汇总如表1所示。
图1
2. 人类MM细胞的发展进程
为了确定这些细胞簇和肿瘤状态之间的关系，利用Monocle2 R软件包，基于每个簇中识别的标记基因，进行分化轨迹和拟时间分析。MM细胞可以分为早期中期和晚期。基于拟时间的排序，MM细胞开始从cluster 1和6（state 1，大多数细胞来自具有细胞遗传学有利的t(11;14)易位的MGUS、NDMM或RRMM患者)，转移到cluster 0和3（state 2、3、5、6和7，所有细胞均来自无t(11;14)或t(4;14)易位的SMM或NDMM患者），并最终转移到cluster 5、2和4（state 4，大多数细胞来自具有细胞遗传学高风险t(4;14)易位的SMM或RRMM患者）（图2a-c），表明MM细胞按拟时间排列，与肿瘤的实际发展阶段一致。
t-SNE分析表明，晚期（state 4）和早期/中期的细胞可以明显区分（图2d）。Venn图显示，晚期有294个(34.7%)特异性标记基因（图2e）。此外，作者还检测了各个簇中MM细胞的代表性基因的表达情况（图2f，g）。
图2
3. MM晚期细胞标记基因的功能分析
Cluster 2、4和5的标记基因主要富集到蛋白质修饰相关的GO和KEGG通路，这可能与骨髓瘤细胞异常蛋白过度积累的特点有关（图3）。
图3
4. 与MM进展相关的基因signature的识别与验证
以GSE24080为训练集，采用单变量Cox回归分析，探讨MM晚期细胞（cluster 2、4、5）的463个标记基因的预后价值。随后，对90个与MM患者OS显著相关的基因进行LASSO回归分析，最终获得20最优基因集，构建了风险评分模型。基于该模型，将559例患者分为高风险组和低风险组。Kaplan-Meier分析显示高风险组和低风险组的生存率有显著差异（图4a）。ROC分析结果显示该模型在预测生存率方面优于之前已发表的模型（图4b）。风险评分、生存状态和基因表达热图分布如图4c，e所示。
此外，作者基于验证数据集GSE9782进行了数据验证（图5）。
图4
图5
5. 20个基因signature独立于传统的临床因素
采用单变量和多变量Cox回归分析评估GSE24080和GSE9782数据集中20个基因signature的独立预测价值。结果显示该20基因预后模型与OS保持显著相关性，提示20基因signature是预测NDMM患者预后的独立常规因素（表2）。
6. 与MM进展相关基因的临床意义
基于具有治疗信息的验证数据集(GSE9782)，这20个基因signature成功地在硼替左米（PS-341）治疗组中稳健地区分高风险和低风险患者，而地塞米松（DEX）治疗组则没有显著差异（图6）。
图6
7. 关键基因的验证
采用qRT-PCR进一步验证20个关键基因在20个MM患者浆细胞中的表达水平（图7）。此外，根据每个样本的20个基因表达值计算出的风险评分中位数，将20例患者分为高风险组和低风险组。高风险组患者与LDH升高显著相关，而LDH升高是MM患者预后不良的一个指标。
图7
8. 基于GSEA的通路分析
利用GSEA研究了这20个基因可能参与的通路。结果显示，高风险组E2F靶信号通路、MYC靶信号通路、G2M Checkpoint信号通路、展开蛋白应答信号通路和DNA Repair信号通路显著激活，而KRAS信号通路、炎症反应信号通路和通过NFKB的TNFA信号通路被抑制（图8）。
图8
小结
总之，作者利用scRNA-seq数据将15例不同分期MM患者的单个细胞按MM风险水平的增加分为7个主要的簇，揭示了细胞遗传异常与MM细胞分化轨迹之间的关系。此外，基于bulk基因表达谱，进一步构建了一种优良且稳健的20个基因signature，可以作为一个独立的生物标志物来预测MM患者的生存。
整体而言，这篇文献的分析思路中规中矩，所用的数据均来自公共数据库，由于将scRNA-seq结合进来，影响因子瞬间达到5分+，如有不清晰可联系小编一起学习哦！
