上次我们学习了一些基础知识,那么我们接着来学习,我们知道,现在大家一般称传统的核酸杂交技术为正向杂交,但是要明确的是基因芯片采用的是反向杂交技术,也就是将各种不同的探针按有序的方式固定到固相支持表面上,之后再与样本中标记的靶基因进行杂交。
基因芯片的价值和分类都不相同,这也就造成了最后我们的观察结果存在差异。简单介绍一下,也就是按照基因芯片的制备方式来分类,分为两大类:原位合成芯片和直接点样芯片,那么还可以根据芯片的介质来分类,具体的分类大家如果有兴趣可以进行了解哟。
本次我们主要来介绍一下表达谱基因芯片的检测方法。
基因芯片的制备与检测在时间和空间上可以完全分隔开来,那么我们来介绍一下利用基因芯片进行转录水平基因表达检测的实验方法。
我们知道基因表达谱检测芯片检测的对象主要是真核生物基因表达的产物mRNA。在实验中对样本的选择要求较高。
mRNA抽提纯化大都采用传统的分子生物学方法,唯一的要求是该方法应尽可能多的抽提出mRNA。
下面我们来看一下参考方案:
(1) 将超低温保存的样品取样称重,转移至用液痰预冷的研钵中,并对其进行研磨,在研磨过程中不断加入液氮,直至研磨成粉末状。
(2) 将研磨后的样品转移至已经加入适量UNLzol试剂的匀浆管中,并置于冰浴中,在组织匀浆粉碎机上进行匀浆,匀浆至匀浆液不黏且无颗粒即可。
(3) 将匀浆液转移至15ml离心管中,于4摄氏度下,12000g离心10分钟。
(4) 小心的吸取上清液转入新的15ml离心管,在室温下放置5分钟。
(5) 向匀浆液中加入三氯甲烷,震荡离心管,在室温下放置3分钟。
(6) 于4摄氏度下,12000g离心15分钟,吸取上清液转入另一新的15ml离心管。
(7) 加入异丙醇,轻轻颠倒离心管充分混匀液体,在室温下放置10分钟。
(8) 于4摄氏度下,12000g离心10分钟,弃上清液,用75%乙醇洗涤2次。
(9) 室温干燥沉淀5分钟。
(10) 加入含RNase的Milli-Q水完全溶解RNA沉淀后,于-80℃条件下保存。
以上就是相关的步骤,下次我们将一起学习mRNA的样本标记方法,下次见哟。


